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如何利用3D打印技术制备载细胞复合水凝胶体系促进骨软骨再生

发布时间:2024-08-12 19:54 浏览次数:

随着老龄化人口和运动损伤率的上升,骨软骨 (OC) 缺损正成为一个严重的全球健康问题,组织工程植入物为缺损区域提供机械支撑,并作为生物活性因子载体招募原位细胞或重塑局部不利微环境,提示了 OC 再生的潜在替代方法。

本期,EFL以发表在杂志《The Innovation》的“3D-bioprinted anisotropic bicellular living hydrogels boost osteochondral regeneration via reconstruction of cartilage–bone interface”研究为例,解析如何利用由甲基丙烯酰化明胶(GelMA) 和甲基丙烯酰化海藻酸盐 (AlgMA) 制成的复合水凝胶作为生物墨水,精确打印同时将关节软骨祖细胞 (ACPC) 和骨髓间充质干细胞 (BMSC) 嵌入分层中的各向异性双细胞活水凝胶 (ABLH),促进骨软骨再生。   


为什么选择ABLH

甲基丙烯酰化明胶(GelMA)具有出色的打印能力和快速的光交联特点,可提高生物打印的可行性。基于GelMA 出色的生物相容性和 AlgMA 的易操作性,该研究通过双通道挤出生物3D打印技术制造了由 GelMA 和AlgMA组成的各向异性双细胞活水凝胶 (ABLH)。可将软骨来源的ACPC和骨髓来源的 BMSC分配到 ABLH 的分层中,保持了高细胞活力。此外,与均质水凝胶相比,ABLH 中的新软骨和软骨下骨同步再生率更高,能够调节的软骨-骨-血管串扰,实现更好的软骨-骨界面。

如何制备ABLH

(1)GelMA和AlgMA的合成及生物墨水制备:将类型A猪皮明胶或海藻酸钠分别溶解在50°C的PBS中,然后分别加入甲基丙烯酸酐进行反应。之后,将溶液稀释并在40°C下用蒸馏水透析3天,冷冻干燥3天。在使用前分别进行2小时的紫外线灭菌,随后将GelMA溶解在37°C的PBS中,加入光引发剂和AlgMA,搅拌均匀,并加入悬浮细胞,制备成生物墨水。(EFL可提供系列GelMA和AlgMA水凝胶产品,详询文末区域销售)

(2)ABLHs的生物打印:使用3D生物打印机进行生物打印,在室温下以70 kPa的压力挤出不同比例的生物墨水,逐渐增加挤出压力直到线条顺利挤出或达到最大70 kPa,针头尺寸为0.3 mm,线条间距设为0.5 mm。(EFL可提供系列挤出式生物3D打印机,点击链接,查看详情)

ABLH的优势和作用

(1)ABLH具有较好的物理机械性能和生物相容性
当 GelMA 和 AlgMA 混合时,复合生物墨水保持有效的剪切稀化行为和温度相关模量,能够快速交联。在室温下以细胞友好的挤出压力直接打印,并在光交联后保持构建体的稳定结构。此外,ABLH具有较好的生物相容性,适用于 OC 再生,其中7G3A 是进一步研究的最佳比例。其上方为 ACPC(3 毫米高),下方为 BMSC(5 毫米高)(图1)。

图1 复合生物墨水的制备和可打印性


(2)ABLH 的体外异质谱系分化
分别从兔软骨和骨髓中分离的软骨祖细胞 ACPC 和骨祖细胞 BMSC 在体外单层培养中进行表征和比较。两种细胞形态相似,然而,BMSC 的克隆形成和增殖能力比 ACPC 强。随后,使用 3D 生物打印制备了 ACPC 或 BMSC 负载水凝胶,由于在生理温度下可打印的优势,生物打印水凝胶促进了内部细胞的存活、增殖和扩散。在体外双层模型中可见,水凝胶一层为无细胞层,另一层包裹细胞,ACPCs 和 BMSCs 分别在 7 或 14 天内扩散(图2)。

图2 复合生物打印水凝胶支持嵌入细胞的存活和增殖


为了进一步评估两种细胞类型在早期或晚期的定向分化的潜力,将含有 ACPC 或 BMSC 的水凝胶分别暴露于软骨或成骨培养基中进行 7 或 14 天的诱导。软骨特异性基因(Col2a1、Acan 和 Sox9)的表达水平在体外分化过程中逐渐增加。番红 O 染色显示,在含有 ACPC 的水凝胶中,C-ECM 逐渐改善,免疫组织化学染色显示COLII和ACAN 的表达在 3D 培养平台中显著增加。差异表达基因的热图显示,软骨形成正调控基因的表达水平增加,但负调控基因的表达水平受到抑制。深入的通路分析表明,激活的线粒体 ATP 合成和氧化磷酸化与 ACPC 向软骨细胞谱系分化有关。骨特异性标志物的表达水平在 BMSC 负载水凝胶中上调,茜素红染色可见O-ECM逐渐增强。热图显示成骨正调控基因Gli3、Ddr2 和 Bmp2/4/7 26 的表达水平显著增加,同时负调控基因Mdk、Hdac7和Grem1的表达被抑制。除此之外,在 BMSC 分化为成骨细胞谱系时还发现了昼夜节律信号传导。综上所述,ABLH 在体外 3D 培养中分别促进了 ACPC 或 BMSC 的成软骨和成骨分化(图3)。  

图3 负载ACPC 或 BMSC 的生物打印结构对软骨形成或成骨的影响


(3)ABLH 促进体内软骨修复
为了探索 ABLH 在软骨或骨再生方面的潜在治疗益处,在兔股骨滑车沟中建立了全层 OC 缺损模型。根据术后 6 周的大体和组织形态学图像,缺损组中软骨修复仅发生在主要由纤维结缔组织组成的 C-ECM 稀少的表面。无细胞水凝胶表现出脆弱的软骨连接和空洞骨结构,相比之下,三种载细胞水凝胶表现出相对完整的 OC 单元,形成了软骨基质丰富的区域,ABLH 有助于位于软骨和软骨下骨上部的 C-ECM合成,此外,手术后 12 周,除缺损组的 OC 单元不完整外,四个水凝胶治疗组的形态重建均已完成,其中BMSC 水凝胶比 ACPC 水凝胶显示出更完整的软骨下骨结构,ABLH 的软骨再生效率比 ACPC 水凝胶高 23.5%,总的来说,这些发现表明 ABLH 促进软骨的修复和更新。

图4 ABLH 促进体内软骨再生


(4)ABLH 促进体内骨重塑
通过微型计算机断层扫描分析和组织学观察详细检查了 ABLH 对骨重建的潜在治疗效果。植入后 6 周,与缺损组相比,无细胞水凝胶对骨量改善的作用有限,表明仅靠机械支撑不足以推动新骨形成,ACPC 水凝胶倾向于在表面形成纤维组织状连接,在深层留下囊腔,不仅诱导下层骨重建,还保持上软骨层的完整性,提供合适的软骨和骨发育环境。成熟骨和COLI 的特异性染色显示,双细胞水凝胶实现了仿生骨再生,具有高度自然的微观结构,与含有 BMSC 的水凝胶相比,骨结构成熟度高出 20.8%(图5)。   

图5 ABLH 加速了体内软骨下骨的形成和重塑


(5)ABLH 协调软骨-骨-血管串扰以进行 OC 单元重建
在体外软骨生成的过程中,携带ACPC的水凝胶中血管生成逐渐减弱,基因集富集分析(GSEA)进一步证实了血管生成的抑制作用。基于基因本体论(GO)的热图显示,早期的软骨生成过程中有新血管形成,但在软骨成熟和分化结束后,这些血管的生成明显减少。在体外成骨过程中,携带BMSC的水凝胶中血管生成逐渐增加,GSEA分析证实了在分化过程中血管的逐步形成,GO分析表明,血管生成、重塑和新血管的扩张对于成骨过程中骨基质的重塑必不可少。体内实验中,通过免疫荧光染色可见,BMSC水凝胶更倾向于促进骨生成,而含有ACPC的水凝胶更有利于软骨生成。在骨关节炎的进展过程中,软骨下骨区的H型血管数量增加,甚至侵入软骨组织,通过抑制H型血管的形成,可以平衡软骨代谢并减轻骨关节炎的症状。在双细胞水凝胶中,H 型血管被限制在骨层中,而不会穿透和扰乱软骨稳态,对于获得更和谐的软骨-骨界面至关重要。总之,ABLH 重新配置了成骨细胞-软骨细胞相互作用,以实现分层 OC 单元重建(图6)。   

图6 ABLH 协调软骨-骨-血管串扰以重建 OC 单元


总结

该研究构建了负载细胞的ABLH,可在室温下直接打印,保持了细胞生长和分化的能力。在体外3D培养系统中,ACPC可分化为软骨细胞,BMSC可分化为成骨细胞。原位植入的ABLH在体内OC缺陷模型中实现了上层软骨细胞外基质(C-ECM)和下层骨细胞外基质(O-ECM)的特异性重建。从机制上看,ABLH通过时空调控软骨-骨-血管的相互作用,促进了仿生OC单元的重塑。该研究提出了一种利用活细胞的双层水凝胶生物适应性策略,为高效修复OC缺陷提供了一种全新的方法。

文献来源:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10746383/

来源: EngineeringForLife

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