基于人诱导多能干细胞来源心肌细胞的功能性心肌组织直接3D打印构建

生物制造的一个目标是通过设计组织、器官或它们的一部分来研究或治疗治疗方法有限的疾病，如终末期器官衰竭。但是当前传统生物制造方法具有细胞难定殖，不能生成有层次的结构等局限性。鉴于目前生物制造的局限性，特别是在心脏组织工程领域，需要开发一种方法，利用生物3D打印将人体诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）直接打印到功能性心脏组织中。然而，直接打印活细胞已被证明是困难的。

来自德国埃尔朗根大学的T.U. Esser团队于2023年9月在ADVANCED MATERIALS发表了一篇名为《Direct 3D-Bioprinting of hiPSC-derived Cardiomyocytes to Generate Functional Cardiac Tissues》的文章，文中提出了一种直接3D生物打印人类诱导多能干细胞(hiPSC)来源的心肌细胞的方法——在胶原透明质酸墨水中，以准确和可重复的方式打印厘米大小的功能性环形和心室形状的心脏组织。打印的组织含有hiPSC衍生的心肌细胞，具有组织良好的肌体，并表现出自发和规律的，持久的收缩，而且能够抵抗被动受力。打印心脏组织的跳动频率可以通过药物刺激来调节。这种方法为产生复杂的功能心脏组织提供了新的可能性：可以用于制造高级药物筛选的模型，也可以用于器官修复或替换的组织移植。实验结果与讨论

一、悬浮支撑浴的制备
凝胶内悬浮打印需要一个支撑浴。支撑浴一方面提供足够的稳定性来保持打印液体墨水的形状，另一方面能够使打印喷嘴通过。为了将hiPSC衍生的心肌细胞(hiPSC-CMs)打印成复杂的形状，该团队开发了一种简单的三步双组分方案，通过复杂凝聚生产明胶/阿拉伯胶微粒。微颗粒以圆形为主，(直径69±27 μm，图1b,c)。通过离心压实后，微粒形成了具有自愈特性的支撑浴，允许打印喷嘴自由通过。即使容器被倒置，打印到支撑浴中的食用染料也能保持在原位(图1d)。

在测试频率范围内，支撑浴显示出固体状行为以及剪切稀化行为(图1f)。此外，在交替剪切速率下，支撑浴表现出近乎瞬时和完全的恢复行为(图1g)。

二、胶原蛋白/透明质酸生物墨水能够精确和重现复杂结构的打印

为了评估胶原蛋白在上述支撑浴中的可打印性，该团队用不同浓度的胶原墨水打印脱细胞环状结构(图2a)。此外，透明质酸(HA)（一种糖胺聚糖），被添加到胶原蛋白中，以改善生物墨水的可打印性。为了评估印刷环的均匀性和印刷过程的再现性，用多个印刷环的图像生成重叠图(图2a)。

随着胶原蛋白含量的增加，重叠图显示出更均匀的印刷环，边界更光滑，其中用4.0mg/ml胶原蛋白原液制成的油墨可重复性更好(图2a)。HA明显改善了≥2.0 mg/ml胶原打印环的均匀性 (图2b)。随着胶原和透明质酸浓度的增加，强度谱显示出更小的差异。该团队最终选择了由3.0 mg/ml胶原- i和3.0 mg/ml HA (CollHA3-3)组成的生物链进行进一步的研究，因为其在实际测试中，提供了最高的再现性以及对挤出速度的最佳控制，且打印出的环的壁厚较薄。

为了检验打印过程的准确性，该团队打印了不同的几何形状(环形、网格和星形)。打印结构具有明确的尖锐边缘，可以准确地再现底层3D模型(图2c)。交替使用对比剂和不使用对比剂(同心圆或堆叠矩形)打印CollHA3-3，可以得到连续稳定的结构，表明两种油墨在跨层融合(图2d)。

三、环形功能性心脏组织的可重复和准确的3D生物打印

为了生产有层次结构的组织或器官，控制细胞分布是很重要的。因此，在印刷前需要将细胞掺入油墨中。为了评估细胞的添加是否会影响墨水的可打印性，该团队将25 Mio/ml hiPSC-CMs加入到CollHA3-3墨水中，用以打印环状组织。所得到的环是稳定的，并表现出良好的均匀性 (图3a)。

在组织构建后(第0天)和制造后7天（第7天)使用钙黄素- am /乙锭同二聚体-1（EthD-1)对打印的组织和通过滴铸生产的组织进行染色。在任何时间点，铸型组织和打印组织的活力均无显著差异。

在第30天通过免疫荧光染色观察hiPSC-CMs的切片和整个组织的形态和分布。打印的hiPSC-CMs显示出典型的肌合成α-肌动蛋白条纹，以及缓慢的骨骼肌钙蛋白- i (ssTnI)和心脏肌钙蛋白- i (cTnI)(图3b)。打印组织中α-肌动蛋白的表达均匀分布(图3c)。同时，ssTnI的表达水平向组织边缘升高，证明了打印的hiPSC-CMs的行为与分化和铸造的hiPSC-CMs相似，表明了打印的hiPSC-CMs生成了有组织的肌瘤，并且具有相互连接的不同成熟状态的hiPSC-CMs。

45个打印组织中在第3天已经表现出了自发的同心收缩(图3D)。通过Fluo-4荧光强度的增强和减弱反映了打印组织在收缩周期中表现出钙的同步流入和流出 (图3f)。测量不同区域的荧光强度可以识别出起搏中心(ROI3，图3g)，其行为随着时间的推移显示出高同步性，远处区域达到荧光强度峰值的延迟约为100 ms(1帧)(图3g)。这进一步证明了hiPSC-CMs在打印组织内形成了相互连接的网络。

为了适用于作为模型系统或移植，工程心脏组织必须对药物刺激表现出生理反应。因此，对打印组织首先用肾上腺素能激动剂苯肾上腺素(PE)处理，然后用维拉帕米(Ver)处理（一种l型钙通道抑制剂）。PE刺激导致收缩频率翻倍，但收缩程度并无显著变化(图3i,j)。随后加入维拉帕米，收缩停止(图3i,j)。

四、打印的心脏组织对被动阻力施加同心力

为了检验打印的环是否可以施加类似于心脏的同心圆力，该团队设计并制造了由六个柔性柱组成的阵列(图4a)。将打印的环转移到柱阵列上，并在柱子周围压实，培养至第30天(图4b)。在收缩周期中，打印的环能够同步使6根柱子发生偏转，说明它们能够对阻力施加同心圆力。

与自由漂浮的环一样，这些环在第3天出现了自发收缩。到第28天，收缩频率在每分钟20次左右保持稳定，第30天略有下降(图4c)。在第30天进行PE和Ver处理。PE刺激显著增加了被动机械刺激环的收缩频率 (图4f)。根据柱挠度计算打印组织的产生的力，PE刺激后产生的力增加(图4g)。Ver处理显著降低了收缩频率和产生的力，24个环中有22个停止了跳动(图4f、g)。这里打印的环所产生的力与仅由人类多能干细胞衍生的心肌细胞产生的力相似。

五、胶原蛋白/透明质酸墨水3D生物打印人类心脏心室功能模型

为了测试该方法是否能够实现人类心脏心室功能模型的3D生物打印，团队设计并打印了一个高度为14毫米，最宽处直径为8毫米的模型(图5a)。

心室在制造后7天达到稳定，并发生自发的同步收缩，在培养过程中持续长达100天(图5b,c)。此外，PE刺激可使培养30 天的打印心室模型收缩频率加快 (图5d)。对染色心室的分析显示，hiPSC-CMs在第100天显现出典型的α-肌动蛋白和cTnI的条纹(图5e)。hiPSC-CMs分布在整个打印组织中，α-肌动蛋白和cTnI表现出相似的表达模式(图5f)。实验表明：该组织至少可以培养100天。

总结
本文展示了直接打印嵌入胶原基生物墨水的hiPSC-CMs生成功能性心脏组织的方法。以下结果可有力支持这一结论：hiPSC-CMs可以精确且可重复地3D生物打印成多种形状的心脏组织，并形成相互连接的、自发和同步收缩网络，并且可以通过药物刺激来调节频率；打印组织能够对抗被动阻力发生收缩。这里开发的方法为生成复杂的功能性心脏组织开辟了新的可能性：直接打印hiPSC-CMs以及打印其他细胞类型的方法，可用于打印健康和患病的心脏模型。此外，精确放置不同心肌细胞亚型的能力，加上在生物墨水中添加导电材料的技术，在未来可以进一步模拟整个组织中的动作电位传播，以更准确地复制心脏电生理。

参考文献
Tilman U. Esser, Annalise Anspach, Katrin A. Muenzebrock, Delf Kah, Stefan Schrüfer, Joachim Schenk, Katrin G. Heinze, Dirk W. Schubert, Ben Fabry, Felix B. Engel*(2023). Direct 3D-bioprinting of hiPSC-derived cardiomyocytes to generate functional cardiac tissues

https://doi.org/10.1002/adma.202305911

来源： 生物打印与再生工程